微生物限度過濾的所有驗證方法的操作都需要在陽性接種間完成。

**、霉菌和酵母菌計數(shù)法的驗證

驗證方法 取試驗可能用的*低稀釋級供試液進行驗證。驗證試驗至少應進行 3 次**的平行試驗，并分別計算各試驗菌株每次試驗的回收率。

    1.常規(guī)法

    就是取1∶10的供試液lml和 50~100個試驗菌株加入到1個平皿中，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平        皿，培養(yǎng)，計算各菌株的回收率。

    常規(guī)法做一個樣品的**、霉菌和酵母菌計數(shù)驗證試驗，需要多少個平皿呢?

        試驗組∶5×2=10個，即每個菌株做2ml共需10個

        菌液組∶5×2=10個，即每個菌株的加菌量，每株2個皿        共24個

        本底菌組∶2個**計數(shù)，2個霉菌和酵母菌計數(shù)

    **計數(shù)驗證所用的平皿共14個，其中6個用于試驗組計數(shù)，6個用于菌液組計數(shù)，2個用于**本底菌計數(shù)，傾倒營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;霉菌和酵母菌計數(shù)所用的平皿共10 個，其中4個用于試驗組計數(shù)，4個用于菌液組計數(shù)，2個用于霉菌本底菌計數(shù)，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基）。

    回收率=【（試驗組菌數(shù)-本底菌組菌數(shù)/菌液組菌數(shù)】

    當大腸埃希菌，金**葡萄球菌，枯草桿菌3個菌株的回收率均達到70%以上時，**計數(shù)用該驗證的方法檢驗。

    當白色***和黑曲霉 2個菌株的回收率均達到70%以上時，霉菌計數(shù)用該驗證的方法檢驗。

    2.培養(yǎng)基稀釋法

    取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定**、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時，取同稀釋級的供試液 2ml，每lml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計數(shù)。每lml 供試液所注的平皿中生長的菌數(shù)之和即為 1ml的菌落數(shù)，計算每 1ml 供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù);控制菌檢查時，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。

    具體操作∶（以1ml分至5個皿為例）

    就是取1∶10的供試液 1ml均勻分注到5個平皿中，每個皿0.2ml，每株試驗菌平行制備 2ml的平皿數(shù)，然后加入相應的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計算各菌株的回收率。

    用該法做一個樣品的**、霉菌和酵母菌計數(shù)驗證試驗，需要多少個平皿呢?

        試驗組∶5×10=50個，即每個菌株做2ml共需50個

        菌液組∶5×2=10個，即每個菌株的加菌量，每株 2個皿       共80個

        本底菌組∶10個**計數(shù)，10個霉菌和酵母菌計數(shù)

    3.離心沉淀集菌法

    取一定量的供試液，3000轉/分離心 20分鐘（供試液如有沉淀，先以 500轉/分離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。然后用此稀釋液進行檢驗。

    4.薄膜過濾法

    取相當于每張濾膜含1g 或lml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每 1g 或 lml所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液 lml，過濾。用 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或**瓊脂培養(yǎng)上。每種菌株至少制備一張濾膜。即每個驗證樣品至少制備7個膜。（5個試驗組和 2個本底菌）